Son père, le peintre Raymond Bonheur encourage et soutient ses enfants dans cette voie : Auguste, Juliette et Rosa. Sa mère, de père inconnu, est adoptée par un riche commerçant bordelais, Jean-Baptiste Dublan de Lahet. Rosa Bonheur se plaira à imaginer que le mystère de ses origines maternelles cache quelque secret d'État, qu'elle est de sang royal, mais on sait à présent que Dublan de Lahet, était en fait son véritable grand-père.

Elle passe plusieurs années à la campagne, au Château Grimont (Quinsac), où elle a la réputation d'être un garçon manqué ("J'étais le plus garçon de tous"), réputation qui la suivra toute sa vie et qu'elle ne cherchera pas à faire mentir, portant les cheveux courts et fumant des havanes.

Homosexuelle, elle a vécu deux passions. L'une pour Nathalie Micas, rencontrée en 1837 (Rosa avait 14 ans et Nathalie 12), qui deviendra peintre comme elle et dont elle ne sera séparée qu'à sa mort en 1889 ; l'autre, après le décès de Nathalie Micas, pour une Américaine, Anna Klumpke, également peintre, avec qui elle vivra dix ans, jusqu'à sa mort, et qui sera sa légataire universelle.

Paradoxalement, la vie excentrique que menait Rosa Bonheur n'a pas fait scandale à une époque pourtant très soucieuse des conventions. Pour l'anecdote, Rosa Bonheur dut cependant réclamer aux autorités policières l'autorisation de s'habiller en homme — ou plus précisément, de porter des pantalons — pour fréquenter les foires aux bestiaux (autorisation de travestissement, renouvelable tous les six mois auprès de la préfecture de Paris).

Élève de son père, elle expose pour la première fois au Salon en 1841. Elle obtient une médaille de 3e classe au salon de 1845 et une médaille d'or au salon de 1848. L'année suivante, elle y expose le Labourage nivernais (Musée d'Orsay), commande de l'État. Avec le Marché aux chevaux (MET, New York), présenté au salon de 1853, elle connaît une gloire internationale qui lui vaudra d'effectuer des voyages au cours desquels elle sera présentée à des personnalités telles que la reine Victoria. Elle rencontrera aussi l'impératrice Eugénie, ou encore le Colonel Cody (Buffalo Bill), qui lui offrira une authentique panoplie de Sioux.

En 1859, elle s'installe à By, coteau viticole de la commune de Thomery en Seine-et-Marne, où elle installe son atelier et aménage des espaces pour ses animaux.

Première femme artiste à avoir été nommée Chevalier dans l'ordre de la Légion d'honneur en 1865 — elle reçoit cette distinction des mains de l'Impératrice elle-même[1] — elle sera promue officier de cet ordre en avril 1894. Elle décède le 25 mai 1899 au château de By et est inhumée au cimetière du Père-Lachaise (division 74). Les tableaux, aquarelles, bronzes et gravures de son atelier ainsi que sa collection particulière seront vendus à la galerie Georges Petit à Paris du 30 mai au 8 juin 1900.